近红外光谱在食品微生物检测中的应用

　　随着人们生活水平的提高，食品安全问题日益成为关注的焦点。据统计，全球每年增加腹泻病例15 亿个，造成 300 多万名儿童死亡，其中 70%是由于各种致病性微生物污染的食品和饮水所致。为此，食品检验显得日益重要，而微生物检验又是食品检验的一个重要内容。快速而准确检测出被称为“头号杀手”的食品致病菌，是确保食品安全的首要任务。但是传统的微生物检验方法 （包括反复增菌、菌落分离及多种生化和血清学鉴别实验），不仅步骤复杂，而且耗时费力，难以适应飞速发展的现代食品生产和流通的需求。为了确保食品的安全性，开发快速检测食品有害微生物的方法非常重要。目前，人们在微生物快速灵敏检测技术上投入了大量的精力。本文综述几种食品微生物检测技术，并提出一种新的检测方法。

1 几种微生物快速检测技术

 1.1 色谱技术

　　色谱技术的原理是将微生物细胞经过水解、甲醇分解、提取，以及硅烷化、甲基化等衍生化处理后，使之分离出尽可能多的化学组分供气相色谱仪进行分析。所得到的不同微生物的色谱图中，通常大多数的峰是共性的，只有少数的峰具有特征性，可被用来进行微生物鉴定，分析检测各种常见细菌、酵母菌和霉菌等。

　　汤丹剑用全细胞水介皂化及甲醋法，通过气相色谱仪检测了几株食品微生物细胞长链脂肪酸的构成。结果表明，在食品微生物领域中，利用细胞脂肪酸的差异性，进行菌种的快速鉴别是可行的，其鉴定结果与传统鉴别的结果相符。Newark 微生物鉴定系统就是用气相色谱法检测一种饱和脂肪酸 （微生物代谢物） 的含量，达到鉴定微生物的目的。

 1.2 化学比色法

　　常用的化学比色法包括各种检测试剂和试纸，这两者都是利用迅速产生明显颜色的化学反应来检测待测物质，可通过与标准比色卡比较进行目视定性或半定量分析，随着检测仪器的不断发展，与其相配套的微型检测器也相应出现。在微生物检测方面，美国3M公司的 petrifilm TM Plate 系列微生物测试片，可分别检测菌落总数、大肠菌群计数、霉菌和酵母计数。

 1.3 阻抗技术

　　阻抗微生物学是用电阻抗作为媒介来监测微生物代谢活动的一种快速检测方法。其原理是微生物在生长过程中，可把培养基中的电惰性底物代谢成活性底物，从而使培养基中的电导性增大，培养物中的阻抗随之降低，不同的微生物在培养基中可产生具有作为诊断依据的特征性阻抗曲线，根据电阻改变图形，对检测的细菌进行鉴定。

 1.4 免疫分析技术

　　免疫分析技术是以抗原与抗体的特异性反应为基础，通过病原物刺激机体产生免疫球蛋白 （抗体） 而建立的。酶联免疫吸附法是一种固相酶免疫分析方法，它把抗原抗体免疫反应的特异性和酶的高效催化作用有机结合起来，既可测抗原，也可测抗体，可进行定性和定量测定。ELISA 法可检测食品中沙门氏菌、军团菌、大肠杆菌 O157 等微生物。姚永忠等人将 ELISA 法用于对食品中单增李斯特氏菌的检测，最低检测限为 104 cell/mL，且特异性好，检测时间比常规方法缩短 4~5 d。但该方法所用的检测时间较长，检测灵敏度和特异性也有待提高。

 1.5 生物传感器技术

　　根据检测信号不同，可将生物传感器分为电化学生物传感器、压电生物传感器和光生物传感器；按照生物活性单元的不同，可分为酶生物传感器、微生物传感器、DNA 生物传感器和免疫生物传感器。

　　在病原微生物的检测中，蔡豪斌等人将微生物活细胞新陈代谢产生的电子转移转换为传感器的电流输出，研究了传感器对大肠杆菌、啤酒酵母、霍乱弧菌及卡介菌苗的响应，并实际测量了发酵罐中啤酒酵母菌总数及鲜牛奶中的细菌总数，取得较好的结果。

1.6 聚合酶联反应技术

　　聚合酶联反应 （PCR） 是一种核酸体外特异性扩增技术，通过基因扩增检测微生物的存在。该方法通过对人工难以培养的微生物相应 DNA 片段的扩增，检测扩增产物含量，从而快速对食品中的致病菌含量进行检测。将 PCR 技术与其他技术相结合 （如与氧化酶法相结合），可在食品检验中发挥更大的作用。

　　李晓红等人用免疫磁珠和复合 PCR 联用的方法，从样品中直接浓缩获取单增李斯特氏菌，灵敏度达 115 cfu/mL，检测时间仅 24 h，结果通过 API 方法确认，符合率达 100%。

 1.7 基因芯片技术

　　将各种基因寡核苷酸点样于芯片表面，微生物样品 DNA 经 PCR 扩增后，制备荧光标记探针，然后再与芯片上的寡核苷酸点杂交，最后通过扫描仪定量和分析荧光分布模式来确定样品中是否存在某些特定微生物。

　　杜巍对近年来基因芯片技术在食品微生物、食品转基因成分等检测研究中的基本原理、方法和应用进行了阐述，并综述了基因芯片技术在食品检测中存在的问题、解决方法与发展方向[7]。采用基因芯片技术检测水和食品中常见的致病细菌及其毒素、真菌毒素、病毒、支原体、衣原体、立克次氏体等微生物，具有快速、准确、易于操作等优越性。

1.8 蛋白质芯片技术

　　蛋白质芯片是对固相载体进行特殊的化学处理，再将已知的大量蛋白有规律地固定其上，根据这些生物分子的特性，捕获能与之特异性结合的待测蛋白，然后用激光扫描系统或 CCD （电感耦合器件） 获取数组图像，最后用专门的计算机软件进行图像分析、结果定量和解释。

　　朱俊友等人研究了蛋白质芯片技术及其在食品致病菌检测中的应用[8]，制作出了能满足食品致病菌检测的速度快、准确性高、通量大等发展趋势的蛋白质芯片。该技术存在的问题集中在芯片的制作上，是一项还不完全成熟的技术。

 1.9 生物学发光检测法

　　生物学发光检测法利用细菌细胞裂解时会释放出三磷酸腺苷 （ATP），使用荧光虫素和荧光虫素酶，可使之释放出能量、产生磷光，而光的强度就代表ATP 的量，从而推断出菌落总数。

　　以上这些方法不同程度地改进了传统方法检测成本高、速度慢、效率低、盲目性等缺点，但或多或少都存在不足之处。随着生物、化学、材料科学，以及计算机技术的进步，新的快速检测和识别方法层出不穷，人们试着寻求新的方法以取代传统的微生物检测方法。

2 近红外光谱检测技术

　　近红外光 （NIR） 是一种介于可见光 （VIS） 和中 红 外 光 （IR） 的电磁波，美国材料检测学 会（ASTM） 将其定义为波长为 780~2 526 nm、波数为12 820~3 959 cm- 1 的光谱区。近红外光谱记录的是分子中单个化学键的基频振动的倍频和合频信息，它常常受含氢基团 H- X （C、N、O） 倍频和合频重叠主导，所以在近红外光谱范围内，测量的主要是含氢基团 H- X 振动的倍频和合频吸收。有机物分子对近红外光谱的各个波长具有不同的吸收率，在光谱上表现出波峰和波谷。因此，近红外光谱主要用于对有机物的定性鉴定和定量分析。

 2.1 近红外光谱检测技术在微生物领域的应用

　　据资料显示，有学者用中红外光谱分析法对微生物的分类进行过研究，如 Curk 等人用中红外光谱法进行了酵母菌的分类鉴别研究；Helm 等人对某些细菌的细胞组成用红外光谱法进行了鉴别等。研究表明，这些微生物大分子不仅在中红外谱区有吸收，在近红外谱区也有吸收。Janie Dubois 等人利用细菌细胞在不同波长范围（1 000~2 350 nm） 的近红外吸收特性，通过近红外光谱技术对细菌进行了分类鉴定，从而揭开了近红外光谱技术在微观世界应用的序幕。

　　徐宝成介绍了近红外光谱技术在微生物检测中的工作原理，综述了该技术在微生物的分类鉴别和未知样品的分析等领域的研究状况，并对近红外光谱技术的应用前景作了展望。细胞的近红外光谱能够反映核酸、蛋白质、糖蛋白和生物膜等分子在细胞内的含量、构型、构象及其所发生的变化，但近红外光如何作用于微生物的细胞壁、细胞质，细胞壁和细胞质在近红外光作用后会发生怎样的变化等问题，目前尚不清楚。

 2.2 近红外光谱检测技术在食品安全中的应用

　　基于近红外光谱技术检测快和无污染的特点，它在食品安全方面的研究应用备受研究者的关注。张宁等人对近红外光谱定性分析技术在食品安全中的研究进展进行了综述；姚家彪等人对红外光谱技术在食品种类和产地鉴别、食品中有毒有害成分检测及食品中农药残留检测和食品掺假鉴定等方面的应用作了详细介绍；陈建军等人对近红外光谱技术在食品安全检测方面的应用进行了综述；黄艳等人简述了近红外光谱技术在食品组成成分、食品品质、食品生产和食品安全等 4 个方面应用的最新进展，详细介绍了在食品种类和产地、食品真伪和掺杂、食品中有害物及转基因检测等食品安全检测方面的应用。

　　在果蔬方面，通过近红外技术，可以实现对其质量参数的准确、快速的测量，如可对果蔬的糖度、酸度，维生素、蛋白质等营养成分的含量，以及内部有无病虫害等质量参数进行评定，对蔬菜中氯氰聚酯农药残留进行研究；在农作物方面，可以应用于对蛋白质和淀粉等的检测；在肉制品方面，近红外技术不仅可以用来测定水分、蛋白质、脂肪含量等指标，将经过冷冻的肉分离鉴别出来，同时还可以测定肉的保水性和渗透性，以及肉汁的损失率和干物质的含量；在乳品工业中，采用近红外技术测定牛奶中的脂肪、蛋白质和乳糖等多种主要成分；在酿酒工业中，近红外技术可以用来测定白酒中的乙醇含量、啤酒的酒精度、原麦汁浓度和总酸含量等，还可用来检测啤酒中微生物；在调味品工业中，近红外技术可以用来检测食醋中的总酸和还原糖含量，判断其品质；在粮食产品掺假的鉴定中，Marina 等人通过 PLS 和以小波为基础的定标运算方法，鉴别硬质小麦粉掺杂普通的面包小麦粉，结果建立的近红外光谱可鉴定出掺假面粉，得到了理想的结果。

3 近红外光谱技术在微生物检测中的应用展望

　　李斯特氏菌、沙门氏菌和大肠杆菌等食品致病菌，已经成为威胁食品安全的头号杀手，如何快速而准确地检测出这些致病菌，是有效遏制这些杀手、确保食品安全的首要任务。

　　近红外光谱技术作为一种新型的分析技术，在食品安全领域具有广阔的应用前景，但许多问题还处于探索阶段。可以通过食品中致病菌的 FTNIR 谱来获得细胞壁的组成及其生物大分子结构的信息，继而分离出食品中致病菌的特征光谱带，通过研究近红外光对其生物细胞的作用机理，为建立一种快速简便的检测方法提供依据。在食品中微生物的检测方面，近红外光谱技术将成为一种方便和快捷的现代检测技术。因此，开展近红外光谱技术在微生物检测领域的应用研究，意义重大且任重而道远。