用傅立叶变换红外光谱 (FT-IR) 进行细菌分类

 通常细菌的分类工作是根据细菌的形态学和生物化学反应来进行的。然而，这些测试工作比较耗费时间，而且需要专业知识及专门的培训才能完成。通过检测细菌的红外光谱然后进行化学计量学分析显示出了很大的优越性( 包括在测试速度及结果的一致性方面 )。20 世纪 50 年代末首次尝试了这种方法，并取得了一些成果，但是在仪器以及数据后处理工具方面也暴露出一些局限性。

　　傅立叶变换红外光谱 (FT-IR) 的出现使细菌的红外光谱分析工作在上个世纪 80 年代又复兴了起来。FT-IR 光谱的高信噪比，良好性能，加上计算能力的大大进步，使其在细菌分析方面的应用非常可行。Hopinson 和 Naumann 小组是应用 FT-IR 进行微生物鉴定和鉴别的先驱。最新研究表明这种方法对病原菌和非病原菌的分析也非常有效。

　　传统的红外光谱法是将光束透过 ZnSe 窗片上的细菌样品 ( 经干燥 ) 来进行的。即使用效率最高的制样方法，每天最多也只能分析 50 个样品。然而，近年来硬件和软件领域均取得了很大进展，科学家们可以获得强大的高通量筛选硬件和软件工具，这些工具可以为他们提供最快速的测样率。测试效率上的提高很大成分上归功于全自动化的数据采集和分析方法。化学计量学应用统计学和数学工具通过模式识别进行分析，可以从多变量化学数据中提取有效信息。

 正因为食品工业急需一些快速、环保的分析方法进行质量控制和过程监测，所以具有此特性的 FT-IR 在很多领域已得到广泛应用，诸如食用肉的质量评价，发酵过程的监测，反式食用油脂含量的测定以及酒精饮料的分析等。而细菌筛选在食品生产，尤其像奶酪生产中是一个热门话题。食品中含正确的菌种 ( 而非其他菌种 ) 是非常重要的。欧洲已呼吁制定严格的法规强制食品生产者进行频繁的测样。因此，如果 FT-IR 能够大大的提高测试速度并保证结果的一致性，那么将会在食品工业中发挥重大作用。

　　位于法国Poligny的国家农业研究协会的INRAURTAL组织已经证明FT-IR非常有效。作为一个研究机构，它在社会学、材料学及生命科学等 100 多种学科领域做了研究，主要关注环境、农业、食品及营养问题。该组织主要目的是在这些领域通过拓展知识、开拓创新，为国家和私营企业、组织提供咨询服务。营养部、化学食品安全部和消费行为部的工作主要是降低化学来源的食品危险，提高食品质量。2006-2009 年期间 INRA 的研究工作重点主要包括减少化肥的使用，降低与有毒杀虫剂有关的污染，发展一套完整的保护措施以及与食品相关危险的评价和预防等。因此，在 INRA-URTAL 的研究工作中分析食品中的细菌是其非常重要的一项工作。本次试验旨在验证 FT-IR 方法能否提高分析细菌样品的能力，如果能够证明，它将为食品生产商提供其急需的、符合食品工业法规的质量控制和生产效力。

实验

 INRA-URTAL 的 Le Fier 先生使用 Thermo ScientificNicolet ™ 6700 FT-IR 光谱仪 ( 配备 KBr 分束器 ) 来采集光谱。微孔板附件包含一个内置的氘代硫酸三甘肽 DTGS 检测器，通过透射方式进行数据采集。样品板由矩形硅片 ( 用PTFE 模板分成微孔 ) 构成。Thermo Scientific 的 ArrayAutomation ™软件添加于 OMNIC ™光谱软件中，通过此软件进行实验设置和数据采集。用 Array Automation ™中的TQ Analyst ™通过判别分析进行数据处理。将生长在培养皿上的丙酸、嗜温和嗜热细菌样品通过两种方法转移到硅片上。图 1 显示了实验过程 ( 包括从培养皿上转移细菌以及随后的一系列处理 )。第二种方法的快速、不费力已得到证实，主要是将细菌进行干燥处理，然后重新悬浮于水中，最后再将悬浮液直接干燥于硅片上。

 　 采用 4cm-1 的分辨率扫描 100 次 收 集 光 谱。 图 2显示了微孔板的准备。A1孔保留作为背景采集，A 列剩下的 7 个孔空白。每种待测细菌设 8 个重复，填充于每一列，因此，每一列的序号即表示不同的材料。采集所用 89 个孔的数据用时大约 134 分钟 (~90 秒 / 孔 )。同时还拍摄了每孔的影像图片。采集了已知的每种细菌样本的 FT-IR 光谱，使用这些光谱通过光谱与每种细菌之间的指认生成一种判别方法。由于种类颇大的变化，光谱范围的选择以及光谱数据处理至关重要。通过数学方法来定义每一种类的特征。然后未知样品通过马氏 (Mahalanobis)距离来进行指认，此距离代表了未知样品与每一种类的相似程度。每个都被指认为最接近的种类，同时通过比较得到与相邻的种接近程度的报告。为了直观起见分析结果用不同的颜色编码。

结果

　　所测试的丙酸、嗜温和嗜热菌株真的显示出了预想的情况。例如，在瑞士式的奶酪生产中出现了丙酸细菌。在生产的**阶段，使用乳酸菌来将乳糖转变为乳酸。在成熟过程中，丙酸菌又将乳酸转变为丙酸、乙酸和二氧化碳。奶酪中的空穴是由二氧化碳气泡形成的，而丙酸赋予奶酪坚果型香味。嗜热菌在高温下大量繁殖，而嗜温菌表现功能的**温度范围在正常温度范围 (25-40˚C)。嗜热和嗜温细菌在奶酪的生产以及食物变质方面发挥重要作用。如图 3 所示，光谱及导数结果非常相似。从一列微孔 ( 同一种类细菌 ) 获得的一组光谱非常类似，一阶导数光谱 ( 消除了基线变化 ) 同样也很相似。

　　与图 3 有所不同，图 4 显示了一横行之间 (7 种不同的材料 ) 数据及导数的显著性差异。谱图的后半部分的差异性非常清楚 ( 尤其在导数光谱上 )。这些对照结果是判别分析的基础。使用一系列已确定的细菌克隆体的光谱作为区分细菌的数据库。图 5 显示了判别分析的结果。坐标轴代表相关程度，相似的光谱形成一个簇。理论上一个簇应该只由一种细菌组成并紧密的堆积在一起，与其他簇表现出显著的差异。在 80 个样品系列中出现了两个错误分类。

 　 图 6 显示了表格结果的一个子集，即用两种不同制样方法得到的细菌样品的校正结果。

　　然后使用校正过的判别分析鉴别 96 微孔板上的细菌。这种用阵列自动化软件的处理方法可以取代用色彩显示采集和采集后结果的处理方法。图 7 显示了使用标准方法制备的微孔板的结果。图 2 显示的是使用简化方法得到的结果。每列的颜色基本一致，结果的重复性还是非常高，颜色上的微小变化代表了细微差异的存在。每列表现出高度的符合性，而每行显示出差异性。

结论

　　用标准方法平均每天可分析 50 个样品。而将 ThermoScientific 微孔板阅读仪和阵列自动化软件相结合使得处理一个微孔板只需大约 2 个小时，一天可以分析 350 多个细菌样品，能快速得到结果并且能保证结果的一致性。通过使用 TQ Analyst 化学计量学软件进行分析，彻底消除了操作者的影响和干扰。此外，Thermo Scientific Nicolet 6700傅立叶变换红外光谱仪的灵活性和高通量，使食品生产商能更好的监控生产过程，使其符合食品工业法规的要求。