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果汁中添加外源糖检测技术的研究进展 近年来，随着消费者生活水平的提高，果汁消费量也日益增大。但是，随之而来出现了不良生产厂家通过故意往果汁中掺假蒙骗消费者，以减低生产成本，获得更大市场利益的现象。这显然严重损害了消费者的利益，甚至危害消费者的身体健康。调查显示，随着检测手段的不断提升，掺假技术亦越来越复杂，因此对于果汁掺假的检测也越来越难。目前果汁中掺假的方法主要包括：加水稀释、加糖、添加其他果汁或果渣提取液，以及添加果汁中本身不含有的成分等。 果汁中最主要的可溶性固形物为糖类，向纯果汁中添加廉价糖溶液是最普遍和最常见的果汁掺假方法。目前很多廉价的甜味剂可用于果汁掺假，主要包括甘蔗还原糖、甜菜还原糖、转化或半转化糖浆、高果糖玉米糖浆和水解菊粉糖浆等几种。甜菜还原糖主要成分为蔗糖，而甜菜转化糖经过酸或酶解后可水解成50％的甜菜转化糖(beet medium invert sugar，BMIS)和92％～95％的中间转化糖(medium invert sugar，MIS)。高果糖玉米糖浆(high fructose corn syrup，HFCS)是由玉米淀粉通过酶异构化成不同比例的葡萄糖和果糖溶液，商业HFCS包括HFCS42(含42％果糖)和HFCS55(含55％果糖)两种。对于果汁类食品，糖类物质含量丰富，主要的糖类物质为果糖、葡萄糖和蔗糖。果汁中外源糖掺假检测非常困难，首先因为与果汁中主要碳水化合物组成相似的甜味剂非常多；其次由于不同种属、成熟度、气候、生产区域、季节、加工过程以及贮藏环境不同，水果本身糖分组成存在差异，这就给掺假果汁的检测带来更大难度。目前针对果汁加糖的主要鉴别方法有中红外(mid infrared spectroscopy，MIR)和近红外光谱法(near infrared spectroscopy，NIR)、同位素分析法、核磁共振法(nuclear magneticresonance，NMR)、色谱法等检测方法。本文就果汁外源糖检测技术的研究进展进行分析和综述，比较各检测方法的优缺点，同时阐述相关的化学计量法，为果汁添加外源性糖的掺伪鉴定提供参考。 采用NIR和FT．IR法快速筛选果汁中甜味剂的添加最早由英国国家食品中心提出，目前在国内外有很多报道。如：Le6n等采用NIR-ATR法对英国主要农庄果近两年19种150个不同苹果样品进行检测，以添加HFCS(含45％果糖和55％葡萄糖)和糖溶液(含60％果糖、25％葡萄糖和15％蔗糖)配制产的不同浓度掺假苹果汁为对照组。测试结果显示该方法可以预测苹果汁添加糖成分的情况，其中对添力[IHFCS检测限为9．5％，添加糖溶液的检测限为18．5％，两者混合的为17％。Vardin等通过FT．IR光谱法与化学计量学方法鉴别石榴浓缩果汁与葡萄浓缩果汁，FT—IR结果显示两种果汁在1 780 l 865 cm。1间存在明显差异；并采用化学方法测定了果汁的糖度，通过主成分分析(principal component analysis，PCA)分析样品主成分以及偏最小二乘分析(partial least squaresanalysis，PLS)建立糖度与FT．IR光谱图模型，其相关系数可达0．991 6。在此基础上，通过对FT．IR光谱图做PCA分析区分果汁种类，再通过PLS分析可以评测果汁 掺假浓度情况，预测模型相关系数较高。Sivakesava等采用中红外光谱分析苹果果汁中外源性甜菜以及蔗糖还原糖的掺假情况，然后通过典型变量分析化学计量法对800～1 500 cm。1区域的图谱进行分析，可以比较准确鉴别苹果汁中添加外源性糖的种类，最后通过PLS和PCA分析比较准确的预测了苹果汁中添加的甜菜和甘蔗还原糖的浓度。 有报道显示采用不同的红外分析制样技术所建立的鉴伪预测模型，预测能力不同，而基于果汁状态特性，应用较多的则是衰减全反射制样(attenuated total．reflection，ATR)技术。Rodriguez．Saona等采用FT．NIR透射制样法和反射制样法分析果汁中特有的糖类物质，经二次求导转换，对其中糖的特征吸收谱带光谱数据，采用偏最dx--乘回归(partial least squares regression，PLSR)和交叉验证统计方法建立标准模型，并将该模型与高效液相色谱法(high performance liquidchromatography，HPLC)和标准酶分析进行比较。结果显示，由透射光谱图建立的模型的相关系数R2达99．9％，能够准确的预测果汁中糖含量，可以作为果汁质量控制或者是果汁掺假中糖类物质的一种快速、准确、无损检测手段。Kelly等采用傅里叶变换衰减全反射红外光谱法(FTIR—ATR)对224个苹果原果汁样品以及4对添加了部分转化甘蔗糖浆(partially inverted cane syrup，PICS)、甜菜糖浆(beet syrup，BS)、HFCS以及一种果糖、葡 萄糖和蔗糖混合液的共480个掺假苹果果汁进行红外分析，结合PCA、近邻算法(K．nearest neighbor，KNN)以及PLS等统计方法进行数据分析。结果显示FTIR可作为纯果汁与掺假果汁测试的快速方法，准确度较高。Jha采用FTIR．ATR法和化学计量法测定鲜榨芒果汁和市售芒果汁的添加糖含量，通过与对照样品比较650～4 000 cm4的光谱图，采用PLS分析判定样品加糖与否，最后通过多变量回归分析发现对于添加外源糖的检测限与果汁本身固形物含量相关。He Jian等采用FTMIR．ATR法，测定52种原果汁以及从中提取的高糖和高酚组分样品，并通过阶层式集群分析(hierarchical cluster analysis，HCA)和簇类独立软模式法(soft independent modelling by classanalogy，sIMcA)算法建立多变量模型，结果发现，高酚组分模型比原果汁、高糖组分模型对于不同产区果汁的区分能力更大，模型预测达到零失误。Irudayaraj等采用FTIR．ATR法和化学计量法对鲜榨苹果汁与市售苹果汁中蔗糖、葡萄糖、果糖等糖含量，以及柠檬酸、苹果酸等酸含量进行测定，通过PLS回归分析以及PCA分析对950～l 500 cm。1范围内光谱进行标准模型建立，并用HPLC方法对该模型进行验证。结果显示，该校正模型总的相关系数可达0．998。G6mez．Carracedo等采用 FTMIR—ATR对市售苹果果汁饮料中果汁含量进行测定，以蔗糖、果糖和葡萄糖混合溶液为对照，通过多变量分析分别对总糖含量与蔗糖比例、果糖和葡萄糖比例两种模式进行判别。结果显示从市售果汁的光谱图数据中减去与浓度相同的3种糖溶液的光谱图数据，这样更容易判别不同样品差异性。Socaciu等以拉曼光谱为辅助手段，采用FT．IR法对25％蔗糖对照样品、纯橙汁、纯苹果汁以及掺糖果汁进行测定，实验结果显示，通过红外图谱中峰的数量可以对果汁种类进行区分。而与对照谱图相比，谱图中吸收峰强度大于对照的为100％原果汁，小于或等于对照的则为添加外源糖的掺假果汁。Leopold等以葡萄糖、蔗糖和果糖不同比例混合样为标样，采用FT．IR对这些标样以及28种市售果汁进行测试，结果显示，采用PCA可以对果汁种类进行区分，PLS对果汁的FT．IR数据进行模型建立和预测，测得的葡萄糖，果糖和蔗糖含量与HPLC法测定结果相比相关系数分别为0．88、0．92和0．98，测定结果准确性较高。对桃汁、橙汁和苹果汁样品分析显示，当果汁体积分数较低(4％～50％)，而测得蔗糖浓度含量较高时，可判定为果汁中加入外源蔗糖，用以保证果汁的甜度。 2 同位素分析法 稳定同位素被广泛用于诸如橙汁和苹果汁等果汁质量控制鉴伪中，其原理是根据某些元素同位素天然丰度(含量比率)的变异(以6表示)。在食品分析中常用13C、2H和180 3种元素作为食品掺假检测的手段。物源示踪研究结果显示自然产物中的同位素组成差异非常小，引起植物中稳定同位素组成不同的原因主要是由于其经历不同的光学作用循环，人工合成的产品和化合物具有不同同位素丰度，因此，这对于纯天然化合物和人工化合物的区别成为可能。物光合作用固定CO：遵循C3、C4或景天酸代谢(crassulacean acid metabolism，CAM)途径，各种植物的碳同位素比率13C，12C(d”C值)不同而且稳定。因此通过样品的稳定性碳同位素分析，可以判断某些外源糖类的添加。大多数果汁如桔汁、橙汁、苹果汁及柠檬汁来源于C3植物，d13C的负值较大。而掺假物质大多为蔗糖、玉米糖浆，来源于C4植物，613C负值较小。大多化合物中的稳定同位素多用稳定同位素质谱仪(isotope ratio mass spectrometry，IRMS)进行测定，该方法能够测定食品中特定同位素的准确位置以及含量，而仪器成本较高、且样品前处理时间长，仪器操作较复杂。16C稳定同位素进行果汁外源糖掺假研究在国外较早时间就有相关报道。通过6”C值检测建立了一种对纯果汁中外源性添加糖的鉴伪方法。由于植物(橙子、苹果和甜菜)通过卡尔文循环光合作用产生糖中的613C值比通过哈奇一斯莱克途径产生糖的要低很多(蔗糖)。因此。而消化糖中的扣值可以用于判断纯果汁中甜菜蔗糖的添加。Simpkins等测定了澳洲近五年有代表性鲜榨果汁和缩果汁的稳定碳同位素比例，建立了橙汁鉴伪测试的可靠数据库。结果显示当果汁中613C值高于数据库中3盯时，则表明其中添加了蔗糖；且同种果汁中总糖和总酸之间存在0．7％o～1．5％o差异，当添加糖后，该差异亦发生变化，故而还可以通过该变化进行果汁掺糖进行判断。Rossmann等用13C稳定同位素质谱法，在欧盟、澳大利亚和美国共19个实验室同时对从没有标签的6种果汁(橙汁、葡萄汁、菠萝原果汁、添加15 g／L蔗糖的橙汁、添加15 g／L蔗糖菠萝汁和添加11．8 g／L蔗糖的葡萄汁)中分离出的糖和果肉中的”C进行测试，所有实验室采用同样的实验方法，而在操作者、二氧化碳预处理的转换系统和实验仪器型号不同的实验条件下，得出糖测定的重复性为0．27％，重现性为0．82％；此外，结果显示对于果汁中添加外源糖的检测，13C稳定同位素法可以提高其灵敏度。Jarnina等采用改进”c同位素法对苹果汁中外源糖进行测定，以苹果酸作为内标物。结果显示对添加C4植物糖，玉米与甘蔗蔗糖的检测限均为5％，而对原果汁的检测限则大于10％。李鑫等首先通过液相色谱柱对13种不同产地的橙汁以及掺入2．5％的蔗糖和麦芽糖的掺假果汁中双糖、葡萄糖和果糖进行分离，然后通过同位素比率质谱仪测定分离得到的糖类物质中的613C值，结果显示不同产地橙汁中葡萄糖和果糖的613c值差异较小，而对于掺假的橙汁葡萄糖和果糖的6”C值差异较大，通过对这几种糖类物质的d13c值的相互比较，可以判别出可能掺假的样品。Zhang等运用一种新的国际多维真实规范算法(international multidimensionalauthenticity specification，IMAS)建立了一套石榴汁的鉴伪标准。通过IRMS测定果汁中添加的蔗糖和高果糖玉米糖浆中的13C，12C比值。结果显示当13C，12C比值大于负25960时，表明果汁中掺入了玉米糖浆和蔗糖。 尽管13C稳定同位素法具有较高的灵敏度，然而13C对于同种光合作用循环外源添加糖无法鉴定，这时氘元素含量是一种可以区分同种植物与它们经历相同光合作用途径的代谢产物很好的追踪者。另外，研究表明，由于糖中的羟基很容易与水中的羟基交换，所以糖中总氘元素含量也没有与原始水果中的完全一致。因此可以通过测定果汁水分中的2H和180含量来鉴定果汁加水与否。氘元素含量可以通过SNIF／NMR(点特异性天然同位素分馏)进行测定，果汁外源糖测定分析中，一般采用SNIF—NMR法与IRMS联用法。与IRMS法一样，SNIF—NMR法是目前食品鉴伪分析中***的检测技术，但仪器成本高，操作复杂。 Martin等采用SNIF．NMR法，通过2H位点专一性天然同位素分辨法同时结合1sC稳定性同位素比率分析法，以蔗糖发酵而来的乙醇作分子探针，测定果汁发酵后的2H，1H和180，160比率、乙醇蒸馏物中总的甲基和甲烯基13C，12C和2H，1H比率。结果显示采用因子判别分析可对非浓缩果汁中是否添加甜菜蔗糖进行成功判别。Bricout等采用同位素质谱法对橙汁进行分析，结果显示橙汁中”C，12C比例比甘蔗和玉米糖浆的低，而与甜菜蔗糖的比例相近。基于这个原因，采用SNIF．NMR法进一步测定了橙汁与甜菜中2H，1H比例，结果发现两者差异很大。结果显示测定橙汁中糖的d13C和d2H值，可以检测出添加诸如甜菜、甘蔗或者玉米这些主要工业甜味剂的掺假情况。Kozict等在欧洲标准化委员会(CEN／TCl74)的组织下，经6个欧盟国家的15个实验室以及5个非欧盟国家的12个实验室分别对橙汁和苹果汁中0"D、6180进行测试，结果显示该测定方法具有良好的重现性和稳定性，最后成为用于果汁质量和鉴伪的标准方法(ENV 12141和ENVl2142)。Thomas等研究发现通过SNIF／NMR测定糖发酵后产生的乙醇中定点613C。H：值，可以对于特定CAM代谢植物菠萝果汁中是否添加如甜菜蔗糖等C4代谢途径植物糖源进行区分。且SNIF，NMR法测得6”C。。，值(20％o)比普通的IRMS的测得的613C值(15％o)高出5％o，这样能够提高辨识度和方法的准确性。此外，实验重复性较好，检测限可以达15％糖添加量。 3 NMR法 MR现象来源于原子核的自旋角动量在外加磁场作用下的振动，原子核吸收能量受周围分子原子核的影响，会引起外加磁场强度的改变，因此食品样品的NMR谱图可以提供其详细的分子结构信息。食品掺假研究中，高分辨NMR比低分辨NMR应用更为广泛，。NMR可以测定果汁混合物中不同成分的物理化学性质，带电性质以及分子结构，因此可用于果汁外源糖的掺假分析中。如果分析中使用了质子磁性质，就称为质子NMR(1H-m偶)。NMR方法具有测定结果重现性高，仪器操作和数据分析自动化高，且测定样品量小，样品分析成本较低等优点，目前从测量到检测结果全自动化的果汁质量控制体系已经得到较为全面的应用。 Cuny等采用1H NMR法对葡萄汁中掺入橙汁进行测定，结果显示，对1H NMR谱图采用独立成分分析(independent component analysis，ICA)比PCA更有利于对相似样品的差异性进行判断。Gall等21采用NMR技术对掺入果渣提取液的橙汁进行了测试，对于1H大于300 NMR谱图进行PCA分析，然后使用线性判别分析进行判别，结果显示建立的6种主成分模型对于对照样品和验证样品组的判别成功率可达94％。Vigneau等采用1HNMR对150个已知浓度的原橙汁和掺假橙汁进行测试，对1H NMR谱图采用PLS建立回归模型，并用交叉分级方法对回归模型以及分类方法进行验证。结果显示，对数转换与柏拉图分析联用相关性**，同时选择差别较大的光谱范围比全光谱图建模结果较好。Rinke等采用1HNMR技术与高级统计方法联用的新方法SGF．Profiling，通过一个原始数据，在不同统计模型下与对照数据进行比较可以得出橙汁中添加葡萄等外来水果、添加不同糖浆、果酱清洗液等情况。同时还得出果汁不同地理环境、生产工艺条件下的数据。 4 色谱法 有报道显示，对于果汁掺假的色谱法主要包括气相色谱法和液相色谱法，该类方法分析原理主要是基于果汁样品中的寡糖图谱(即果汁本身的糖含量以及糖组成)或果汁本身特有的其他物质而对于添加的不明高果糖糖浆、甜菜转化糖和蔗糖转化糖等掺假的检测，则是建立在果汁中本身不含有这些甜味剂的基础之上。 色谱法分析果汁掺假时样品前处理比较复杂，准确性不理想，且操作比较繁琐。如采用毛细管气相色谱法(capillary gas chromatograp，CGC)测定果汁中的转化糖，当样品处理温度较高时，由于果汁本身所含还原糖发生导致测试结果成假阳性。尽管如此，果汁外源糖掺假检测中，CGC法仍然是应用较广的方法之一。Low等采用GC．FID检测器对123个纯苹果汁和60个纯橙汁中不含有的高果糖糖浆、甜菜转化糖浆以及蔗糖转化糖浆的掺假情况进行测定。结果显示，每种糖浆的检出限能达5％。Cornil等采用GC—FID法测定柑橘果实中不含有的寡糖(麦芽三糖和麦芽四糖)。结果显示，两种寡糖的检出限约为1 mg／L，但该方法对于添加结晶糖制品的掺假无效。Villamiel等采用CGC法以苯基．声．葡糖苷为内标物对不同橙汁中果糖、葡萄糖、蔗糖和肌醇含量进行了测试。结果显示，与鲜榨纯果汁相比，果汁中果糖和葡萄糖含量较高时，即蔗糖果糖比以及肌醇果糖比较低，则说明果汁中可能添加蔗糖分解产物。而对于具有较高蔗糖果糖比的样品，则可能添加了蔗糖溶液。鉴于蔗糖在高温下易于分解，而肌醇具有较好的热稳定性，因此橙汁中肌醇含量、肌醇与果糖比可作为很好的标志物，辨别果汁的真实性。Low等采用CGC法对加热苹果汁中外源转化糖进行测试，在果汁处理前添加了平衡方法，结果显示与常规CGC法相比，该方法具有更低的变量相关系数，显著降低甜味剂的检出限。而StOber等对苹果汁中不明还原糖添加的CGC测试方法进行了标准化。 采用高效液相色谱法对果汁中添加外源糖的检测时，报道较多的是使用脉冲安培检测器检(pulsedamperometric detector，PAD)，Brause等通过HPLC方法测定果汁中糖以及特有多酚含量来鉴别苹果汁的真实情况。Swallow等采用离子交换色谱一PAD法对橙汁中外源糖进行测试，结果显示，与对照样品比较，该方法检测果汁BMIS掺假检测限可达5％。Wudrich等采用LC．PAD法对原橙汁中添加不同甜味剂进行测定，结果显示，对于42％和55％的高果糖玉米糖浆、50％和80％的蔗糖水解物、甜菜糖水解物的检测限均为5％～10％。Low等采用HPLC．PAD法对葡萄汁添加外源糖进行测定。得出对高果糖玉米糖浆、BMIS甜菜介质转化糖、甜菜转化糖的检测限可达5％，每个样品的测样时间为115min。Zhang等通过HPLC法测得纯石榴汁和掺假果汁中蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖和三梨醇等糖组成数据，结果显示当果汁糖度为16时，石榴汁中特征糖甘露醇含量需大于0．3 g／100mL，葡萄糖和甘露醇比例以及葡萄糖和果糖比例在需分别在4～15和0．8～1．0范围内，否则为掺假。 5 其他检测方法 除上述检测方法外，诸如毛细管电泳法、热解质谱法以及酶法等化学法针对果汁中外源糖检测亦有报道，上述方法主要基于果汁中不同糖的组成、含量差异。Zidkova等利用毛细管区带电泳和基质辅助激光脱附游离飞行时间质谱仪测定橙汁中是否加甜味剂，细管区带电泳间接检测主要的低分子质量糖(葡萄糖、果糖和蔗糖)浓度比例，而MALDI—TOF／MS可测定复杂基质中微量寡糖。虽然低分子质量糖和有机酸会干扰寡糖的检测，但掺假果汁中的低聚麦芽糖浓度足以检出。Garcia．Wass等采用热解质谱与多变量分析法成功区分了添加蔗糖与没加蔗糖的市售果汁，检测限可以达5％，同时还成功区分来自7个不同国家的橙汁。Maireva等通过化学方法测定橙汁中Mg、Ca等微量元素、酸度和糖度，HPLC法测定果汁中果糖和葡萄糖含量，并通过统计方法进行相关线性回归分析。结果显示，果汁含量与矿物质元素和糖含量相关，果汁糖度较低且果汁含量较低时表明果汁掺水，而与对照比相比，糖度较高则这表明添加了外源糖。St6j等通过酶法测定了连续3年草莓、覆盆子、黑醋栗和白醋栗果汁中蔗糖、果糖和葡萄糖含量。结果显示，可以通过果糖、葡萄糖和蔗糖含量以及葡萄糖和果糖比来判断果汁真实性，但是对于品种、成熟度以及生长气候不同的果实榨汁后的果汁相互掺假无法进行判断。6 结语 目前，我国在果汁质量控制方面尚无完善的相关国家标准，现有果汁质量控制标准涵盖范围窄，基本停留于最基础的卫生指标上，而无对果汁含量和种类的细致标准。为规范果汁的生产，促进果汁市场的健康发展，开展果汁标准研究和真假果汁鉴别技术研究势在必行。而且随着果汁市场的快速发展，掺假技术亦越来越复杂；加上果汁本身的化学特性，使得准确检测果汁中外源糖的掺假较难。因此，国家需加大果汁鉴伪相关研究的投入；同时相关科学研究人员需积极借鉴国外成功经验，共同协作，尽快推出快速、易操作、可行可靠的鉴伪方法。相关监督部门需加大该生产链的执法力度，确保果汁质量和产品安全，切实保证消费者利益。
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农业应用
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