用双波长可见光谱法快速测定半纤维素提取液中糖的含量

 生物质资源作为一种巨大的可再生资源，在缓解世界资源短缺与能源危机方面具有较大潜力。“生物质精炼”是近几年国内外的研究热点，国外学者提出了“联合型林产品生物质精炼(integrated forest products biorefinery，IFBR)”的构想，即在木片制浆前增加预处理段，提取木片中的半纤维素
糖，用以转化为高附加值的产品，如生产燃料乙醇、生物柴油和木糖醇等。其中，提取液中主要糖类组分含量的快速测定，对于优化预提取工艺和确定糖的发酵条件将具有重要意义。

　用于多糖含量的分析方法有很多。一类是传统的分析方法，比如测总还原糖的方法如3，5-二硝基水杨酸盐比色法(DNS法)，利用多糖在强酸性条件下的水解产物与酚类缩合生成有色化合物的方法，如地衣酚一硫酸法、苯酚一硫酸法和Douglas法(又称间苯三酚一冰醋酸显色法)，上述方法操作简单，但不能同时分别测已糖和戊糖，Douglas法与上述其他方法相比，测定准确度相对较高。二是现代仪器分析方法，主要包括气相色谱法、高效液相色谱法和离子色谱法。气相色谱分析前需对单糖进行衍生化，工序繁琐且衍生化反应会影响组分定量和定性分析。高效液相色谱法和离子色谱法是目前定性和定量分析糖类组分的**方法，但仪器操作和维护成本很高。因此，建立一种能较准确测定提取液中的主要糖类组分，并操作简单、快速，不需要昂贵仪器的新方法，对于开展生物质精炼的研究是很有必要的。
本文对Douglas法进行改进，采用双波长技术实现对戊糖和己糖含量的同时测定，为植物半纤维素提取液中糖类组分(包括单糖、低聚糖和多糖)的分析提供一种新的手段。研究还对预提取液中其他物质对糖测定结果的干扰影响进行了评价。
1　实验
1．1原料与试剂
　 桉木木片取自广东雷州林业局，风干后装袋保存。本实验所用试剂除D一木糖为生化试剂，其他均为分析纯试剂。
1．2实验方法
  1．2．1标准糖溶液的配制
　 　分别配制不同浓度的木糖和葡萄糖标准溶液，浓度范围为0．5～5．0mmol·L-1；同时配制七述两种糖的混合液，单糖和总糖浓度范围分别为0.58～0.95和1.10～1.55 mmol·L-1
 1．2．2显色反应及可见光谱测定

  准确称取2 g间苯三酚溶于110 mL冰乙酸中，加入10mL无水乙醇和2 mL浓盐酸。混合均匀后静置。待溶解完全后备用。移取1 mL标准糖或样品溶液于25 mL比色管中，加入10 mL显色反应试剂摇匀，在沸水浴中反应10 min后立即冷却，5 min后于SClNC0 s-3100型紫外一可见分光光度计中进行全波长扫描，以空白样进行相同的显色反应作为参比。
 1．2．3半纤维素预提取及木素试样的制备
　 木片中半纤维素的预提取采用高温热水预水解方式，在美国M．／K 609-2-i0型电热蒸煮锅中进行。木素为硫酸盐木素，采用酸析法分离，纯化步骤参照Lundquist方法，提纯木素样品用PL表示，将其溶于稀碱液即得木素溶液试样。

2　结果与讨论
 2．1单糖显色反应原理及其可见光谱
  Douglas比色法的原理是在高温酸性条件下，待测样品中的聚戊糖和聚已糖分别水解为戊糖和己糖，然后脱水转变为糠醛和羟甲基糠醛，再与问苯三酚显色[6]。2．2中图1的光谱结果显示，木糖和葡萄糖在波长553和410 nrn处分别有**吸收，葡萄糖在553啪附近也有微弱吸收，但只有其含鼍远远高于木糖含量时才会对后者的测定产生干扰。因此，传统的Douglas法在显色反应试剂中加入一定量的葡萄糖溶液作为空白，以减小葡萄糖对木糖测定的干扰。很显然，这种消除干扰的方法仍然不适用于葡萄糖含量高的样品。

 2．2　双波长法测总糖、戊糖和己糖的含量
　 图1为不同浓度木糖和葡萄糖显色反应后的可见光谱。可以看出，相同摩尔浓度的木糖和葡萄糖经显色反应后，均在相同波长425 nlTl处具有等吸收，因此425 nln为木糖和葡萄糖的等摩尔吸收波长。由实验得出，波长425 nm处的吸光度与总糖浓度之间的关系遵循朗伯一比尔定律，关系表达式为y=0．1016x(n=6，R2=0.9976，Y为吸光度，x为总糖浓度mmol·L-1)，因此可以由波长处的吸光度值计算总糖含量。

 实验结果还显示，不同浓度的木糖经显色反应后，在波长553 nm处的吸光度与糖浓度的关系也遵循比尔定律，关系方程为y1≈0.6628x(n=6，R2=0．9986，y1为553 nm处的吸光度，z为木糖浓度mmol·L-1)。在没有其他物质干扰的前提下，对于双组分混合糖体系，二者在553和425nm都有吸收，可分别表达为

　式中：c1和C2分别表示戊糖和已糖的浓度，e11和e21分别表示戊糖和己糖在553nm处的摩尔吸收系数，e12和s；分别表示戊糖和己糖在425 rlin处的摩尔吸收系数，A，和A2分别为波长553及425 nlll处的吸光度。

　在等摩尔吸收波长425 nm处，戊糖和己糖的摩尔吸光系数相等，即

　　这里Ct表示总糖浓度。
　 由于相对戍糖而言，同等摩尔浓度的己糖在553 nm处的吸收非常／b(约为戊糖吸收的1．5％～2.0％)，对于阔叶木和禾本科植物，提取液中以戊糖为主，因此己糖在该波长处的吸收可忽略不计，由此可简化为式(5)和式(6)进行计算。

2．3提取液中干扰物质的影响
　 木材半纤维素提取液的成分比较复杂，其中某些含有醛基的有机物质可以与显色反应试剂中的间苯三酚显色，因而可能会对戊糖和己糖的测定产生干扰。提取液中含有醛基的有机物主要为木素、糖醛酸、己糖和戊糖，因此本文主要探讨了木素和糖醛酸对后两者测定结果的影响。图2的光谱显示，葡萄糖醛酸的显色反应产物在553nm有特征吸收，与图1中相同浓度木糖(3．0 mmol·L-1)的结果相比，前者的吸光度(0.39)要比木糖(1．95)低得多。在阔叶木半纤维素中，每9～10个木糖单元就有1个4一。甲基葡萄糖醛酸基侧链，即使木片中的葡萄糖醛酸全部脱落进入预提取液，其所对应的吸光度仅为0．39x0.3／3.O=0．039，干扰比例约2％，因此葡萄糖醛酸的吸收干扰可忽略不计。

 基于半纤维素提取液中的木素含量(<O.1 g·L-1)，评价了木素对混合糖测定结果的影响，结果见图2。很显然，木素显色反应的产物在4254600 nm波长范围内无明显吸收(最高仅0．03)，因此可排除木素对本方法中糖类分析结果的干扰。
2．4方法的精度和准确性评价
　 由重复试验得知，本方法测定戊糖和己糖的e11和e12(e22)的相对标准偏差分别为2．64％和5．83％。为验证本方法用来测定各糖含量的准确性，本文采用已知各组分糖含量的混合糖溶液为基准进行评价，其回收率结果如表l所示。

 表1中的结果表明，采用本方法所测总糖、术糖和葡萄糖的回收率均较高为97.4％～101.9％，证明本方法可以实现对总糖和戊糖、己糖含量的准确测定。

3　结论
　　本研究对传统的Douglas比色法进行改进，采用双波长法实现对戊糖和己糖含量的同时测定。该方法操作简单、快速，可用于植物半纤维素提取液中糖类组分的分析，特别适合于聚戊糖类半纤维素含量较高的阔叶木和禾本科植物。