病斑、病斑附近烟叶和正常烟叶的FTIR研究

　　烟草制品作为一种特殊的消费品和嗜好品，烟叶的质量问题就显得尤为鼋要。影响烟草品质和产量的一个不容忽视的因素就是烟草病害，烟叶生产过程中，从种到收，直至仓存都会发生病害。而传统的烟草病害诊断是通过烟草病害症状出现之后进行症状观察和进行病原物分离而确诊病害，实时性较差。所以，在烟草病害的潜育期对其进行诊断就显得非常重要。所谓病害的潜育期即病原物从与寄主建立关系起到开始表现明显症状为止的时期，从字面卜讲，就是病原物在寄主体中隐蔽地生长发育的时期，人们的感官不能察觉它的存在。

　　植物病害的发生是一个动态的病理变化过程，植物受到病原生物或不适宜的环境条件影响后，首先是生理机能会发生改变，接着引起植物内部的组织结构发生变化，最后才导致植物外部形态的改变，即症状出现。所以，植物在病变过程中，其化学成分会发生变化。光谱技术由于具有分析速度快、效率高、成本低等优点，已成为一种快速、无损的现代分析技术，广泛用于植物病害方面的研究。如冯洁等用多光谱成像技术诊断黄瓜病害；蒋金豹等用高光谱微分指数监测冬小麦病害；陈兵等用高光谱遥感监测棉花黄萎病。多光谱成像技术能同时获取被测目标的光谱信息和卒间信息，可伞面、快速提取植物病害的信息，但不能在症状l叶{现之前诊断病害。高光谱遥感技术诊断植物病害是基于植物遭受病虫害侵染后，生物化学成分含量和外部形态的变化，导致植物反射光谱特性变化，可提前监测、识别病害信息，但植物自身物理参数的确定就存在许多困难，另外所建它的模型仍然受植被类型、农作物品种、生育阶段、生长条件以及测量环境等诸多因素的影响，只能适用于特殊的条件。而利用红外光谱技术研究病斑、病斑附近烟叶和上正常烟叶，诊断烟草病害方面还未见报道，我们用FTIR(Fourier transform infrared spectroscopy)技术结合距离分析对3种典型的叶斑病：角斑病(angular spot)、赤星病(brown spot)和气候型斑点病(weather speck)病斑附近看似正常的烟叶进行研究(其中，角斑病是细菌病害，赤星病是真菌病害，都属于侵染性病害；而气候型斑点病属于非侵染性病害)，并与正常烟叶以及对应的病斑一起进行分析。从差异明显的两个吸收带做了比较，同时探讨了几个特征峰吸光度比和Pearson相关系数的变化趋势，以期为诊断潜育期的烟草病害，提供一个简易可行的思路。

1实验部分
1．1仪器设备和测试条件
　红外光谱仪为PerkinElmer公司生产的Spectrum 100型傅里叶变换红外光谱仪，扫描次数为16次，分辨率为4cm-1，扫描范围为4 000～400 cm～。光谱数据处理使用OMNIC6．0软件，距离分析软件使用SPSS 13．0软件。
1．2样品制备及光谱预处理
　 测试的烟叶从云南省文山烟区采得，并由烟站技术人员鉴定病害种类，样品清洗干净晾干保存待测。取样时避开叶脉取叶片，将烟叶放人玛瑙研钵磨为细粉，再加入溴化钾并搅磨均匀，然后压片测定。每个样品进行3次测试求平均值来消除误差，所有光谱都已扣除背景，并以3 410 cm-1附近的吸收峰为参考进行归一化处理。

2　结果与讨论
2．1病斑、病斑附近烟叶与正常烟叶grIR图谱的差异分析

　　图1为赤星病病斑(图lc)、病斑附近烟叶(图lb)与正常烟叶(图la)的红外光谱图；图2为角斑病病斑(图2c)、病斑附近烟叶(图2b)与正常烟叶(图2a)的红外光谱图；图3为气候性斑点病病斑(图3c)、病斑附近烟叶(图3b)与正常烟叶(图3a)的红外光谱图，仔细对比这3组光谱图。发现差异主要来源于2个吸收带。　

 (1)酰胺和羰基振动吸收带。在这个带的主要吸收峰有3个：1734，1643，1548 cm-1。，其中1734 cm-1附近的峰归属为脂类羰基的振动吸收，1643 cm-1附近的吸收峰主要是酰胺带吸收，归属为C=O的伸缩振动，1548 cm-1附近的吸收是酰胺Ⅱ的振动吸收，归属为N-一H的弯曲振动和C_N的伸缩振动。在这3组光谱图中，正常烟叶和病斑附近烟叶在1 734 cm-1附近都显示了一肩峰，而病斑没有此肩峰。在酰胺Ⅱ带的吸收峰l 548 crrl_1附近，只有图2中

角斑病病斑和病斑附近烟叶显示了一肩峰，其他烟叶都没有显示这个肩峰。所有样品的傅里叶变换红外光谱都是以3410cm-1附近的吸收峰为参考峰进行归一化处理。归一化后我们可以明显看出在酰胺I带吸收峰的强度E，病斑、病斑附近烟叶的吸收峰较强，而正常烟叶的吸收峰较弱。为能定量地反映出这个强度的变化，选用酰胺I带的吸收峰的吸光度和3 410 cm-1附近的吸收峰的吸光度进行比较，即

A1643/A3410，正常烟叶中的比值是0．458。在图l中，赤星病病斑附近烟叶和病斑的比值分别足0．553和0．708，有正常烟叶<病斑附近烟叶<病斑；在图2中，角斑病病斑附近烟叶和病斑的光谱中比值分别是0．560和0．791。即也有正常烟叶<病斑附近烟叶<病斑；在图3中，气候性斑点病病斑附近烟叶和病斑的光谱中比值分别是0．862和0．827，即正常烟叶<病斑<病斑附近烟叶，可以看出与前而两组图中烟叶的吸光度比变化趋势不一样。从吸收峰的强度变化上可以知道病斑和病斑附近烟叶中蛋白质的含量较高，正常烟叶中蛋白质的含量较低。

 （2）多糖物质的特征吸收带。在这个带中1200 ~1030cm-l范围内的多重峰指认为糖营类物质的一OH伸缩振动和碳氧键伸缩振动。在特征吸收峰的峰位和强度七，3组光谱图中，正常烟叶、病斑附近烟叶和病斑的光谱都有一定的区别。正常烟叶在这个吸收带的最强峰出现在1 025 cm-1，吸光度比A1025／A34l0是0．649。在图1中，病斑附近烟叶和病斑的最强峰分别出现在l048和1030 cm-1，A1048／A3410和A1030／A3410分别是0．534和0．462，即有正常烟叶>病斑附近烟叶>病斑；在图2中，病斑附近烟叶和正常烟叶的光谱图很相似，最强峰为一单峰，出现在1 026 cm-1，而病斑烟叶的最强峰是强度相当的双峰，出现在1 074和1 048
cm-1，病斑附近烟叶和病斑的光谱中A1026／A3410和A1074／A3410分别是0．673和0．363，即有病斑附近烟叶>正常烟叶>病斑；在图3中，病斑附近烟叶和病斑的光谱图很相似，都显示了一强度相当的双峰，与正常烟叶的峰形差异比较大，病斑附近烟叶和病斑的光谱中A1026／和A3410和A1074／A3 410分别是0．586和0．444，即有正常烟叶>病斑附近烟叶>病斑。可以看出图2中吸光度比变化的趋势与图l和图3中不一样。从吸收峰的强度变化上可以知道正常烟叶和病斑附近烟叶中多糖物质的含量较高，病斑中多糖物质的含量较低。

 酰胺、羰基振动吸收带和多糖物质的特征吸收带的最强峰之比A1631／A1025，为蛋白质与多糖的相对含量。在正常烟叶的光谱巾吸光度比A1631／A1025是0．706，在图l中，病斑附近烟叶和病斑对应的吸光度比分别是1．036和1．532；在图2和图3中，对应的比值分别为0．832和2．179，1．471和1．863。在3组光谱图中都有正常烟叶<病斑附近烟叶<病斑，其变化趋势相同。
　对于普遍存在的差异而言，吸光度比在一系列的图谱中应该显示相同或者相反的变化趋势，故吸光度比A1631／A1025可以作为判别烟叶是否发生病变的有效指标，而吸光度比
A1643／A3410和A1024／A3410不能作为判别烟叶是否发生病变的有效指标。

2．2病斑、病斑附近烟叶与正常烟叶FrIR图谱的距离分析

　　为了更客观和全面的分析它们的相似程度，我们分别对3组样品的整个光谱区(4 000～400cm-1)的原始光谱和二阶导数光谱做距离分析。距离分析是对观测量或变量之问相似或不相似程度的一种测度，是计算一对变量之间或一对观测量之间的广义的距离。在距离分析过程中，主要利用变量间的相似性测度和不相似性测度度量两者之间的关系。本文中我们采用相似性测度来度母样品问相似程度，用Pearson相关系数来描述任意两个样品光谱之间的相似性，第i个样品与第J个样品间Pearson相关系数的计算公式为

　其中，W为横坐标(波数／era-1)，A为纵坐标(吸光度)，Aiw为第i个样品在W处的吸光度，Ajw为第j个样品在W处的吸光度，

 3组样品的原始光谱和二阶导数光谱距离分析的相似性矩阵，也就是Pearson相关系数矩阵，见表1～3，表1是赤星病病斑、病斑附近烟叶与正常烟叶的相似性矩阵，表2是角斑病病斑、病斑附近烟叶与正常烟叶相似性矩阵，表3是气候性斑点病病斑、病斑附近烟叶与正常烟叶相似性矩阵。从对原始光谱的距离分析来看，在3个表中，病斑、病斑附近烟叶与正常烟叶的光谱都有一定差异，但差异不是很大，Pearson相关系数都达到了0．940以上，且每个表中的3个样品的Pearson相关系数的大小都有这样的关系：病斑附近烟叶与正常烟叶的Pearson相关系数大于病斑与正常烟叶的Pearson相关系数；由于二阶导数使光谱灵敏度提高，所以在二阶导数光谱距离分析的3个表中，病斑、病斑附近烟叶与II：常烟叶的光谱差异一下变得明显：病斑附近烟叶与正常烟叶相父系数，在表1中，由0．984降到r 0．762，在表2和表3中，分别由0．985和0．949降到了0．890和0．580；病斑与正常烟叶的Pearson相关系数，在表l中，由0．970降到r 0．663，在表2和表3中，分别由0．956和0．943降到了0．501和0．484。但每个表中的3个样品的Pearson相关系数却也都有这样的关系：病斑附近烟叶与正常烟叶的Pearson相关系数大于病斑与正常烟叶的Pearson相关系数。原始光谱和二阶导数光谱的距离分析都说明病斑附近烟叶与正常烟叶具有更紧密的关系，而病斑与正常烟叶两者之间的关系更远一些，表明病斑附近烟叶化学成分已经发生一定的变化，但是没有病斑化学成分变化的程度大。

3　结论
　 通过对3组烟叶样品的FTIR分析，发现病斑、病斑附近烟叶与J下常烟叶的光谱在酰胺、羰基振动吸收带和多糖物质的特征吸收带存在差异：病斑、病斑附近烟叶中蛋白质的含肇比正常烟叶高，而正常烟叶和病斑附近烟叶多糖的含量比病斑烟叶高；吸光度比A1631／A1025呈现相同的变化趋势，即：正常烟叶<病斑附近烟叶<病斑。f司时对3组烟叶样品整个光谱区原始光谱和二阶导数距离分析的结果表明，病斑附近烟叶与正常烟叶的Pearson相关系数大于病斑与正常烟叶的Pearson相关系数，即与病斑比，病斑附近烟叶与正常烟叶具有更紧密的关系。吸光度比A1631／A1025和Pearson相关系数的这种变化趋势表明病斑附近烟叶的化学成分在逐渐改变，即病斑附近烟叶处于正常和病变的过度状态。烟叶病变初期不容易通过活检的方法在显微镜下观察出来，而
FTIR光谱是在分子水平上检测样品变化的有力工具，有可能在判断烟叶组织是否病变的题上更加灵敏。故可以把测试烟叶的红外光谱与正常烟叶和病斑烟叶的光谱一起分析，比较吸光度比A1631／A1025的和Pearson相关系数，以确定是否发生病变。该方法为在潜育期诊断烟草病害，提供了可能。具有实用意义。