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基于曲线拟合的普通花叶病烟叶与正常烟叶的FTIR研究烟草普通花叶病(Tobacco Mosaic Virus)是世界各产烟区最常见的一种病毒病,我国各烟区也普遍发生.云南常年发病率在lo%左右,受烟草普通花叶病毒侵染的叶片厚薄不匀,成泡斑,在烤晒后颜色不均,烟味差,品质大为降低. 目前,对普通花叶病的病原、侵染过程以及对烟叶产量和产值的影响已经有了广泛深入的研究,但有关这种病害对烟叶细胞主要成分(蛋白质、多糖、脂等)含量与结构影响的研究非常少.傅里叶变换红外光谱是从分子水平检测样品变化的有力工具,具有高分辨率、高信噪比、快速等优点,辅助以导数光谱、退卷积、曲线拟合等解析方法,还可以研究不同状态下蛋白质二级结构的变化规律,已成功用于分析人体正常组织样品和癌化组织样品中分子含量和结构的变化.本文用傅里叶变换红外光谱仪测试了普通花叶病烟叶和正常烟叶的光谱,从不同光谱区做了比较,并对叠加峰较多的光谱区进行了曲线拟合分析,探讨了病害对烟叶细胞主要化学成分含量和结构的影响. 1 实验和方法 仪器设备和测试条件红外光谱仪为PerkinElmer公司生产的spectrum 100型傅里叶变换红外光谱仪,扫描次数为16次,分辨率为4 cm-1,扫描范围为4 000~400 cm-1.光谱数据处理使用Omnic 6.0软件,曲线拟合使用origin 7.5软件. 样品制备及光谱预处理 测试的烟叶从文山烟区采得,并由烟站技术人员鉴定病害种类,样品清洗干净后晾干,保存待测.取样时避开叶脉取叶片,将烟叶放人玛瑙研钵磨为细粉,再加入溴化钾并搅磨均匀,然后压片测定.每个样品进行3次测试求平均值来消除误差,所有光谱都已扣除背景,并以3 400 cm叫附近的吸收峰为参考进行了归一化处理. 傅里叶退卷积、四阶导数和曲线拟合法 在光谱的Fourier变换域内消除或减小卷积函数的影响,从而使谱线得到细化的方法称为Fourier退卷积技术FSD,利用FSD可以增强红外光谱的分辨能力,并可以将重叠的谱带分开.红外光谱转换成二阶导数光谱以后,再进行一次二阶导数光谱转换,即可变成四阶导数光谱,其分辨能力比二阶导数光谱更强,四阶导数光谱峰的方向是朝上的,与样品吸收峰的方向一致.曲线拟合法是将重叠在一起的各个子峰通过计算机拟合,将它们分解为呈洛伦茨函数分布或高斯函数分布的各个子峰,它是定量测量重叠谱带中各个吸收峰峰高和峰面积的最好方法. 2 结果与讨论 2.1 甲基和亚甲基伸缩振动区的差异分析 从表2中我们可以看出,两种烟叶在这个范围内子峰的位置和面积百分比都存在一定的差异.正常烟叶中CHz反对称伸缩振动吸收出现在2 924 cm-1,普通花叶病出现在2 920 cm-1,而CHz基团反对称伸缩振动谱带能反映出膜脂分子结构的有序化程度,其波数增加反映出磷脂膜内脂肪酰基链旁式构型增多,[8]普通花叶病烟叶此吸收峰向低波数方向位移,即表明烟叶病变以后磷脂膜内脂肪酰基链旁式构型有所减少.子峰1的面积百分比在正常烟叶中是18.91%,在普通花叶病烟叶中是18.56%,表明普通花叶病烟叶中磷脂和脂肪酰基链所占比例稍有减少.子峰2面积的百分比在正常烟叶中是17.87%,在普通花叶病烟叶中分别是18.92%,反映出普通花叶病烟叶中蛋白质成分所占比例增加,而脂类成分所占比例减少.子峰1、3面积之和与子峰2、4面积百分比之和的比值在正常烟叶中是1.63,在普通花叶病中是1.40,表明在普通花叶病烟叶中CH:基团相对含量减少,CH3基团相对含量增加. 2.2酰胺I带吸收区的差异分析 蛋白质二级结构中a一螺旋、p一折叠、p一转角和无序结构的吸收频率主要出现在1 600-,1 700 cm-.1范围内,为了尽量减小误差,客观真实的反映酰胺I带吸收峰的叠加,所以选择的光谱区间为l 710~1 580 cm一.同时由于酰胺I带叠加峰较多,故采用分辨能力强的四阶导数光谱确定各个子峰的位置,经过四阶导数处理后,叠加峰得到了分辨,两种烟叶在1 600"--1 700 cm-1范围内都出现了12个子峰.根据分辨出来的子峰位置,对原始吸收峰进行曲线拟合,光谱经过四阶导数处理和拟合后的图见图3.定义12个子峰中任意一个子峰的面积百分比(A%)为它的面积除以12个子峰面积的总和.参照前人对蛋白质二级结构研究的文献,对各个子峰进行了指认,各个子峰的峰位、面积、面积百分比和归属见表3. 总β一折叠、总无序结构、总a一螺旋和总β一转角的面积百分比在正常烟叶中分别是49.53%、11.30%、19.36%和19.81%,在普通花叶病烟叶中分别是51.oo%、15.69%、15.97%和17.33%.可以看出,与正常烟叶相比,普通花叶病烟叶蛋白质中β一折叠和无序结构的相对含量增加,a一螺旋和β-转角的相对含量减少;其中,无序结构和a一螺旋的面积百分比变化的幅度较大,β一折叠和β一转角的面积百分比变化的幅度较小.蛋白质含量的差异分析所有样品的傅里叶变换红外光谱都是以3 400 cm-1附近的吸收峰为参考峰进行归一化处理.归一化后我们可以明显看出在酰胺I带吸收峰的强度上,普通花叶病烟叶的吸收峰较强,而正常烟叶的吸收峰较弱.为了能反映出这个强度的变化,选用酰胺I带的吸收峰的吸光度和3 400cm-1附近的吸收峰的吸光度进行比较,即A1643/A3400,正常烟叶中的比值是0.458,普通花叶病烟叶中的比值是0.654.从吸收峰的强度变化上可以知道普通花叶病烟叶中蛋白质的含量较高,正常烟叶中蛋白质的含量较低. 3 结论
文章分类:
农业应用
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