基于曲线拟合的普通花叶病烟叶与正常烟叶的FTIR研究

 　 烟草普通花叶病(Tobacco Mosaic Virus)是世界各产烟区最常见的一种病毒病，我国各烟区也普遍发生．云南常年发病率在lo％左右，受烟草普通花叶病毒侵染的叶片厚薄不匀，成泡斑，在烤晒后颜色不均，烟味差，品质大为降低．

　　目前，对普通花叶病的病原、侵染过程以及对烟叶产量和产值的影响已经有了广泛深入的研究，但有关这种病害对烟叶细胞主要成分(蛋白质、多糖、脂等)含量与结构影响的研究非常少．傅里叶变换红外光谱是从分子水平检测样品变化的有力工具，具有高分辨率、高信噪比、快速等优点，辅助以导数光谱、退卷积、曲线拟合等解析方法，还可以研究不同状态下蛋白质二级结构的变化规律，已成功用于分析人体正常组织样品和癌化组织样品中分子含量和结构的变化．本文用傅里叶变换红外光谱仪测试了普通花叶病烟叶和正常烟叶的光谱，从不同光谱区做了比较，并对叠加峰较多的光谱区进行了曲线拟合分析，探讨了病害对烟叶细胞主要化学成分含量和结构的影响．

1　实验和方法

　仪器设备和测试条件红外光谱仪为PerkinElmer公司生产的spectrum 100型傅里叶变换红外光谱仪，扫描次数为16次，分辨率为4 cm-1，扫描范围为4 000～400 cm-1．光谱数据处理使用Omnic 6．0软件，曲线拟合使用origin 7．5软件．

　样品制备及光谱预处理

　　测试的烟叶从文山烟区采得，并由烟站技术人员鉴定病害种类，样品清洗干净后晾干，保存待测．取样时避开叶脉取叶片，将烟叶放人玛瑙研钵磨为细粉，再加入溴化钾并搅磨均匀，然后压片测定．每个样品进行3次测试求平均值来消除误差，所有光谱都已扣除背景，并以3 400 cm叫附近的吸收峰为参考进行了归一化处理．

　傅里叶退卷积、四阶导数和曲线拟合法

　　在光谱的Fourier变换域内消除或减小卷积函数的影响，从而使谱线得到细化的方法称为Fourier退卷积技术FSD，利用FSD可以增强红外光谱的分辨能力，并可以将重叠的谱带分开．红外光谱转换成二阶导数光谱以后，再进行一次二阶导数光谱转换，即可变成四阶导数光谱，其分辨能力比二阶导数光谱更强，四阶导数光谱峰的方向是朝上的，与样品吸收峰的方向一致．曲线拟合法是将重叠在一起的各个子峰通过计算机拟合，将它们分解为呈洛伦茨函数分布或高斯函数分布的各个子峰，它是定量测量重叠谱带中各个吸收峰峰高和峰面积的最好方法．

2　结果与讨论
　 图1为正常烟叶(A)与普通花叶病烟叶(B)的傅里叶变换红外光谱图，表1为两种烟叶红外光谱主要谱峰的峰位和归属．从图表看，两种烟叶的主要谱峰基本类 要似，主要由蛋白质、脂类和多糖物质的吸收带组成；差异主要存在于以下三个吸收区，即：甲基和亚甲基伸缩振动区(3 000~．．2 800 cm-1)，酰胺I带吸收区(1 700～1 600cm-1)，多糖物质的特征吸收区(1 200～950 cm-1)．

2．1 甲基和亚甲基伸缩振动区的差异分析
　　为了分辨出叠加峰，对两种烟叶这个区的光谱进行傅里叶自去卷积处理，然后根据分辨出来的子峰位置，对原始吸收峰进行曲线拟合(高斯拟合)．去卷积后在2 962 am～、2 924 cm一、2 888 Ct23．一、2 852 cm-1附近分辨出吸收峰，其中2 962 cm～、2 924 clTI叫和2 852 cm-1附近的峰分别主要来源于脂类分子的CH3的反对称伸缩振动吸收、CH2的反对称和对称伸缩振动吸收，2 888 cm叫附近的峰主要来源于蛋白质分子的CH3对称伸缩振动吸收．曲线拟合后的图见图2(高斯峰拟合)，拟合结果见表2，定义4个子峰中任意一个子峰的面积百分比(A％)为它的面积除于4个子峰面积的总和。根据朗伯一比耳定理，某个子峰的面积百分比就可看做是这个子峰所代表的基团的相对含量。

　从表2中我们可以看出，两种烟叶在这个范围内子峰的位置和面积百分比都存在一定的差异．正常烟叶中CHz反对称伸缩振动吸收出现在2 924 cm-1，普通花叶病出现在2 920 cm-1，而CHz基团反对称伸缩振动谱带能反映出膜脂分子结构的有序化程度，其波数增加反映出磷脂膜内脂肪酰基链旁式构型增多，[8]普通花叶病烟叶此吸收峰向低波数方向位移，即表明烟叶病变以后磷脂膜内脂肪酰基链旁式构型有所减少．子峰1的面积百分比在正常烟叶中是18．91％，在普通花叶病烟叶中是18．56％，表明普通花叶病烟叶中磷脂和脂肪酰基链所占比例稍有减少．子峰2面积的百分比在正常烟叶中是17．87％，在普通花叶病烟叶中分别是18．92％，反映出普通花叶病烟叶中蛋白质成分所占比例增加，而脂类成分所占比例减少．子峰1、3面积之和与子峰2、4面积百分比之和的比值在正常烟叶中是1．63，在普通花叶病中是1．40，表明在普通花叶病烟叶中CH：基团相对含量减少，CH3基团相对含量增加．

2．2酰胺I带吸收区的差异分析
　  蛋白质二级结构中的差异分析　　酰胺I带的位置对于蛋白质构象的变化非常灵敏，正常烟叶的酰胺I带出现在1631cm-1，普通花叶病烟叶酰胺I带出现在1 625 cm-1，表明普通花叶病烟叶中蛋白质的构象已经发生了变化．为了弄清蛋白质的构象的具体变化，对两种烟叶蛋白质二级结构进行比较。

 蛋白质二级结构中a一螺旋、p一折叠、p一转角和无序结构的吸收频率主要出现在1 600-,1 700 cm-．1范围内，为了尽量减小误差，客观真实的反映酰胺I带吸收峰的叠加，所以选择的光谱区间为l 710～1 580 cm一．同时由于酰胺I带叠加峰较多，故采用分辨能力强的四阶导数光谱确定各个子峰的位置，经过四阶导数处理后，叠加峰得到了分辨，两种烟叶在1 600"--1 700 cm-1范围内都出现了12个子峰．根据分辨出来的子峰位置，对原始吸收峰进行曲线拟合，光谱经过四阶导数处理和拟合后的图见图3．定义12个子峰中任意一个子峰的面积百分比(A％)为它的面积除以12个子峰面积的总和．参照前人对蛋白质二级结构研究的文献，对各个子峰进行了指认，各个子峰的峰位、面积、面积百分比和归属见表3．
　　从表3中我们可以看出，两种烟叶在1 600～1 700 cm-1范围内2～6个子峰的频率位置差异较大，而1和7～12个子峰的频率位置基本一致；大部分子峰面积的百分比都存在着明显不同．差异较大的地方有：(1)普通花叶病烟叶在1 610 cm-1有一吸收峰，而正常烟叶没有此峰；正常烟叶在1 653 cm-1处有一吸收峰，而普通花叶病烟叶没有此峰．(2)正常烟叶最大的子峰为子峰2，出现在1 618 cm-1，而普通花叶病烟叶最大的子峰为子峰，出现在1 659 cm-1．(3)在1 618 cm-1和1 625 cm-1附近的口一折叠结构的振动吸收带上，正常烟叶吸收峰面积百分比分别是22．54％和7．32％；普通花叶病烟叶吸收峰面积百分比分别是9．91％和11．94％，前者小于正常烟叶吸收峰面积百分比的二分之一，而后者约为正常烟叶吸收峰面积百分比的一点五倍．(4)在a一螺旋结构的振动吸收带上，正常烟叶显示了两个吸收峰，出现在1 653 cml和1 659 cm一，面积百分比分别是lo．7l％和8．65％，而普通花叶病烟叶只在l 659 cm-1处显示了一个吸收峰，面积百分比是15．97％．(5)在1 699 cm．1附近的p一转角吸收峰上，正常烟叶吸收峰面积百分比是0.73％，明显小于普通花叶病烟叶此吸收峰面积百分比(为1．16％)。

 总β一折叠、总无序结构、总a一螺旋和总β一转角的面积百分比在正常烟叶中分别是49．53％、11．30％、19．36％和19．81％，在普通花叶病烟叶中分别是51．oo％、15．69％、15．97％和17．33％．可以看出，与正常烟叶相比，普通花叶病烟叶蛋白质中β一折叠和无序结构的相对含量增加，a一螺旋和β-转角的相对含量减少；其中，无序结构和a一螺旋的面积百分比变化的幅度较大，β一折叠和β一转角的面积百分比变化的幅度较小．蛋白质含量的差异分析所有样品的傅里叶变换红外光谱都是以3 400 cm-1附近的吸收峰为参考峰进行归一化处理．归一化后我们可以明显看出在酰胺I带吸收峰的强度上，普通花叶病烟叶的吸收峰较强，而正常烟叶的吸收峰较弱．为了能反映出这个强度的变化，选用酰胺I带的吸收峰的吸光度和3 400cm-1附近的吸收峰的吸光度进行比较，即A1643／A3400，正常烟叶中的比值是0．458，普通花叶病烟叶中的比值是0．654．从吸收峰的强度变化上可以知道普通花叶病烟叶中蛋白质的含量较高，正常烟叶中蛋白质的含量较低．
2．3 多糖物质的特征吸收区的差异分析
　　两种烟叶的红外光谱图在这个范围内都有一个强度大，峰形宽的阶梯峰，这个阶梯峰由三个小的吸收峰组成，这三个吸收峰的峰位基本相同，强度依次增强．正常烟叶和普通花叶病烟叶在这个吸收带的最强峰都出现在l 025 cm-1，吸收强度比A1025／A3400分别是0．649和0．635，即有正常烟叶>普通花叶病烟叶．从吸收峰的强度变化上可以知道正常烟叶和普通花叶病烟叶中多糖物质的含量存在差异．酰胺I带和多糖物质的特征吸收带的最强峰之比A1631／A1025，为蛋白质与多糖的相对含量．在正常烟叶和普通花叶病烟叶的光谱中吸光度比A1631／A1025分别是0．706和1．03，表明普通花叶病烟叶中蛋白质相对含量增加，多糖相对含量减少．

3 结论
　　普通花叶病烟叶与正常烟叶的光谱在三个吸收区存在差异：比如甲基和亚甲基伸缩振动区，普通花叶病烟叶中CHz基团反对称伸缩振动谱带向低波数方向位移，即表明烟叶病变以后磷脂膜内脂肪酰基链旁式构型稍有减少；酰胺I带吸收区，两种烟叶蛋白质二级结构中a一螺旋、β一折叠、口一转角和无序结构出现的吸收位置和所占的比例都存在差异，表明烟叶蛋白质的构象和含量发生了变化；多糖特征吸收区，吸收峰的强度不相同，表明多糖物质的含量发生了变化．这些结果都表明了普通花叶病烟叶与正常烟叶组织中的蛋白质、多糖和脂类等生物分子在含量和结构上存在差异，而这种分子含量和结构的改变是烟叶病变的根本原因．由此，我们可得出如下结论：FTIR可以从分子水平上揭示病害烟叶和正常烟叶的特异性，并能够对烟草病害的研究提供大量振动光谱和化学信息．